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《保健食品用菌種致病性評價程序（征求意見稿）》全文

文章錄入：上海奔爍咨詢 | 文章來源：國家市場監督管理總局 | 添加時間：2019-4-10

1范圍
本程序規定了保健食品生產用菌種（包括細菌、絲狀真菌和酵母）的致病性評價程序。
本程序規定了作為保健食品的活性成分（活菌）和作為保健食品生產發酵用菌株兩類微生物的致病性評價。
本程序適應于保健食品申請審批時對生產用菌種的致病性評價，對用擬評價菌種生產的產品中其他成分的評價，應參照國家相關規定進行。
本程序不適應于基因修飾微生物的致病性評價。
2術語和定義
2.1致病性，Pathogenicity
微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。
2.2 產毒能力，Toxigenicity
微生物產生對人和動物有毒作用的活性代謝產物的能力。
2.3毒性， Toxicity
微生物有毒代謝產物引起的宿主健康損傷。
3擬評價微生物菌種的基本要求
3.1基本信息
菌種名稱(包括學名、俗名、拉丁名等)、來源及用途。
3.2菌種分類學資料
提供由有菌種鑒定資質的檢驗機構出具的對擬評價菌種規范、科學的分類學（屬、種、株名稱或株號）資料。細菌的分類和命名應遵循原核生物系統學國際委員會（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的規定，并符合原核生物國際命名法規（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分類和命名應遵循國際藻類、真菌和植物命名法規（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）進行。
3.3菌種鑒定資料
根據目前已有的知識，提供基于表型或最新基因測序技術確切鑒定到種水平的資料。
3.4菌種生長環境條件資料
提供菌種生長最適培養基及培養條件（培養時間、培養溫度和濕度、光照等），以及菌種保藏及復壯方法等。
3.5誘變菌種
經誘變的菌種還需提供詳細的誘變方法（包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變實驗流程等）。
3.6生產相關信息
包括但不限于安全用于保健食品工業生產的記錄、工藝流程、企業標準等資料。
3.7 其他國家審批資料
提供其他國家批準擬評價菌種作為保健食品或普通食品生產使用的資料；
3.8其他需要說明的信息。
4評價方法
4.1 國內外安全性評價資料綜述
基于國內外文獻數據，提供擬評價菌種的國內外使用歷史、安全性評價資料，包括其致病性和產毒能力的報告、科技文獻或綜述等；若無擬評價菌種的上述資料，應提供同種內其他菌株或與其相近種屬的安全性評價資料。
4.2全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)
4.2.1基因測序
對擬評價菌株進行全基因組測序，提供包括但不限于以下信息：
- DNA提取方法
- 測序方案及儀器設備
- 序列組裝方法
- 序列質量評價
- FASTA 文件
- 與預期基因組大小相關的contigs總長度
- 基因注釋流程
- 對真菌而言，還需提供從相關數據庫中獲得的注釋質量信息。
4.2.2 基因序列分析
將擬評價菌株的基因組序列與已有的數據庫（包括但不限于VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE等）最新版本中存儲的序列進行比對，并分析擬評價菌種遺傳物質中與致病相關的已知毒力因子、毒素代謝基因的存在情況。至少提供包括以下信息的分析報告：
- 毒力（或產毒相關）基因名稱、所在位置、與最新數據庫中已有毒力基因的匹配度等信息
- 編碼的蛋白及序列號
- 毒力因子（毒素產生、侵襲和粘附因子等）
- 同源百分比和e值
- 數據庫中已充分描述過的菌株名稱
- 基因組圖譜
- 擬評價的真菌菌種還應根據文獻報道能夠產生的毒素類別，針對性檢索是否存在毒素合成關鍵基因。
4.3動物致病性試驗
由有菌種致病性檢測和評價資質的機構，按照附錄A、B和C實驗方案進行保健食品用擬評價細菌、真菌、酵母菌種對動物的致病性實驗、評價并出具報告。
4.4 產毒實驗
對某些能夠產生真菌毒素的真菌，應在多種基質（單品種固體、多品種固體復合、不同成分液體組合等）中進行產毒實驗，并按照國家標準檢測方法或國際組織/相關國家規定的標準檢測方法進行有毒活性代謝產物含量檢測。
根據到目前為止我國已批準可用于保健食品的真菌名單，用于保健食品生產用的紅曲霉屬應進行桔青霉素產毒實驗。
5結果判定
5.1出現以下結果一個以上者，則認為菌株的致病風險較低，可作為保健食品生產用菌種
5.1.1三個以上國家批準作為食品或保健食品用菌種且具有長期（30年以上）的使用歷史。
5.1.2全基因序列分析結果顯示不存在已知的毒力相關基因或毒素合成關鍵基因；
5.1.3動物實驗顯示無致病性，
5.1.4產毒實驗結果顯示在受試的基質中均不產生有毒活性代謝產物。
5.2出現以下結果之一者，則認為具有致病風險，不能作為保健食品生產用菌種
5.2.1根據現有知識，全基因序列分析發現存在已知毒力基因（或毒素合成關鍵基因）；
5.2.2動物試驗結果顯示有致病性；
5.2.3產毒實驗顯示在受試的任何一種基質中可產生有毒活性代謝產物。
5.3其他需要綜合判斷的情況
5.3.1全基因序列中發現存在已知毒力基因（或毒素合成關鍵基因），但動物實驗顯示不具有致病性，或產毒實驗未檢測到已知的有毒活性代謝產物；
5.3.2全基因測序列中未發現存在已知的毒力基因（或毒素合成關鍵基因），但動物實驗顯示具有致病性，產毒實驗未檢測到已知的有毒活性代謝產物；
出現上述情況之一者，需結合國內外使用歷史和安全性評價資料、國內外文獻綜述、生產工藝、生產條件、終產品中生產菌種的存在情況等進行綜合判斷。

附錄A
(規范性附錄)
保健食品用細菌致病性試驗方法
1 范圍
本方法規定了保健食品用細菌的致病性試驗方法。
本方法適用于保健食品用細菌的致病性評價。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 電子天平：感量0.1 g。
2.3 錐形瓶：容量500 mL。
2.4 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.5 無菌試管：16×160 mm。
2.6 顯微鏡：10×～100×。
2.7 微量移液器及槍頭：1.0 mL。
2.8 注射器：1.0 mL。
2.9 小鼠灌胃針頭。
2.10 厭氧培養裝置：厭氧罐、厭氧箱。
2.11 Class II生物安全柜
3 培養基和試劑
3.1 0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL生流水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。
3.2 LB肉湯培養基：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB肉湯培養基，備用。
3.3 LB瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書配用蒸餾水制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB瓊脂平板，備用。
3.4 MRS肉湯培養基：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS肉湯培養基，備用。
3.5 MRS瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS瓊脂平板，備用。
3.6 雙歧桿菌瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備雙歧桿菌瓊脂平板，備用。
4 實驗動物
選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。
5 操作步驟
所有擬評價的菌株均必須進行腹腔注射和經口灌胃兩種途徑染毒動物，評價菌株對動物的致病性。
5.1腹腔注射
5.1.1菌種活化與菌懸液制備
到目前為止我國批準的可用于保健食品的細菌菌種主要是雙歧桿菌和乳桿菌，新的申報菌種在以下描述中歸為其他細菌。
根據菌種的培養特征，將雙歧桿菌和乳桿菌接種MRS肉湯、其它細菌接種LB肉湯，并置適宜的培養條件下（包括培養溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養一定時間后，將雙歧桿菌接種MRS瓊脂平板或雙歧桿菌瓊脂平板，乳桿菌接種MRS瓊脂平板，其他細菌接種LB瓊脂平板，培養一定時間后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁法使菌懸液中菌體細胞的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。
5.1.2 腹腔注射
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL，使每只小鼠注射菌量至少107 CFU/只。
5.1.3動物觀察
動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21 d。
觀察動物出現下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周所有小鼠稱量，并測量實驗期間死亡的、最終處死的小鼠體重。若小鼠的存活時間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時間。
5.2 經口灌胃
5.2.1菌種活化與菌懸液制備
除制備菌懸液濃度不小于2.5×108 CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。
5.2.2 灌胃
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，分別以2.0 mL/100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。
5.2.3 觀察
同5.1.3 。
6 結果與報告
對5.1和5.2的實驗結果進行統計學分析，并進行評價，包括：
（1）擬評價菌株對動物體重的影響是否有統計學意義；
（2）動物出現異常特征的時間及癥狀描述、出現異常的動物數目等，包括每只動物的死亡時間；
（3）受試物組動物在實驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長發育等影響無統計學意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或試驗期間影響其生長發育，即可判定該菌種具有致病性。

附錄B
(規范性附錄)
保健食品用絲狀真菌的致病性試驗方法
1 范圍
本方法規定了保健食品用絲狀真菌的致病性試驗方法。
本方法適用于保健食品用絲狀真菌的致病性評價。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 培養箱：28 ℃±1 ℃。
2.2 電子天平：感量0.1 g。
2.3 錐形瓶：容量500 mL。
2.4 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.5 顯微鏡：10×～100×。
2.6 微量移液器及槍頭：1.0 mL。
2.8 比濁儀。
2.9 注射器：1.0 mL。
2.10 小鼠灌胃針頭。
2.11 接種針。
2.11 Class II生物安全柜
3 培養基和試劑
3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。
3.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。
3.3 0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。
4 實驗動物
選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。
5 操作步驟
所有擬評價的菌株均必須進行腹腔注射和經口灌胃兩種途徑染毒動物，評價菌株對動物的致病性。
5.1 腹腔注射
5.1.1 菌種活化與菌懸液制備
將送檢菌種接種于適宜的培養基上，到目前為止我國批準的可用于保健食品的真菌菌種除了紅曲霉屬菌種接種麥芽汁瓊脂平板外，其他菌種均接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28℃±1℃培養7 d～14 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁法菌懸液中孢子的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。
5.1.2注射
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的孢子量不少于107 CFU/只。
5.1.3觀察
動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21 d。
觀察動物出現下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周稱量所有小鼠的體重，并測量實驗期間死亡的、觀察期內存活的、最終處死的小鼠均需稱重。若小鼠的存活時間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時間。
5.2經口灌胃
5.2.1菌種活化與菌懸液制備
除制備濃度不小于2.5×108 CFU/mL的菌懸液外，其他操作步驟同5.1.1。
5.2.1 灌胃
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。
5.2.2 觀察
同5.1.3。
6 結果與報告
對5.1和5.2的實驗結果進行統計學分析，并進行評價，包括以下內容：
（4）擬評價菌株對動物體重的影響是否有統計學意義；
（5）動物出現異常特征的時間及癥狀描述、出現異常的動物數目等，包括每只動物的死亡時間；
（6）受試物組動物在實驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長發育等影響無統計學意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或實驗期間其生長發育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。

附錄C
(規范性附錄)
保健食品用酵母的致病性試驗方法
1 范圍
本方法規定了保健食品用酵母的致病性試驗方法。
本方法適用于保健食品用酵母的致病性評價。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 培養箱：28 ℃±1 ℃。
2.2 電子天平：感量0.1 g。
2.3 錐形瓶：容量500 mL。
2.4 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.5 顯微鏡：10×～100×。
2.6 微量移液器及槍頭：1.0 mL。
2.8 比濁儀。
2.9 注射器：1.0 mL。
2.10 小鼠灌胃針頭。
2.11 溫濕度計。
2.12 接種針。
2.13 Class II生物安全柜
3 培養基和試劑
3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。
3.2 0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。
4 實驗動物
選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。
5 操作步驟
所有擬評價的菌株均必須進行腹腔注射和經口灌胃兩種途徑染毒動物，評價菌株對動物的致病性。
5.1 腹腔注射
5.1.1 菌種活化與菌懸液制備
將送檢菌種接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培養2 d～7 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁調整菌懸液中菌的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。
5.1.2注射
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的菌量不少于107 CFU/只。
5.1.3觀察
動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21d。
觀察動物出現下列（但不限于）異常情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周稱量所有小鼠的體重，并測量實驗期間死亡的、觀察期內存活的、最終處死的小鼠均需稱重。若小鼠的存活時間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時間。
5.3經口灌胃
5.3.1菌種活化與菌懸液制備
除制備菌懸液濃度不小于2.5×108 CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。
5.3.1 灌胃
小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。
5.3.2 觀察
同5.1.3。
6 結果與報告
對5.1和5.2的實驗結果進行統計學分析，并進行評價，包括以下內容：
（7）擬評價菌株對動物體重的影響是否有統計學意義；
（8）動物出現異常特征的時間及癥狀描述、出現異常的動物數目等，包括每只動物的死亡時間；
（9）受試物組動物在實驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長發育等影響無統計學意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或實驗期間其生長發育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。

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